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藻蓝胆素（Phycocyanobilin, PCB）是一种具有线性四吡咯结构的天然蓝色色素，具有抗氧化、抗炎、抗癌等特性。藻蓝胆素可用于帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）的治疗，并可作为逆转 COVID-19 引起的神经损伤的潜在药物。此外，藻蓝胆素可作为材料科学中的重要中间体，是光开关基因操纵器的重要组成部分。
目前，藻蓝胆素主要来源于植物提取和化学合成。前者受到藻类的生长周期长、提取率低、提取过程复杂等限制；后者则面临区域选择性和立体选择性不佳的问题。生物合成被视为合成藻蓝胆素的高效替代途径。
在藻蓝胆素的生物合成中，经常以大肠杆菌为生产宿主，然而，其仍然存在生产水平低、前体缺乏和催化效率低的问题。
近期，江南大学生物工程学院周景文教授团队在增强藻蓝胆素的生物合成方向取得重要进展，其构建的大肠杆菌菌株的藻蓝胆素滴度达到147.0 mg/L，这也是迄今为止报道的最高滴度。相关研究成果以题为 “Enhancement of phycocyanobilin biosynthesis in Escherichia coli by strengthening the supply of precursor and artificially self-assembly complex” 发表于Synthetic and Systems Biotechnology期刊。
从头合成藻蓝胆素
周景文团队基于已有的藻蓝胆素从头合成的路径，针对生产水平低、前体缺乏和催化效率低等问题进一步优化。
已有合成路径概括如下：通过 C4 和 C5 两种代谢途径合成的 ALA（所有四吡咯的共同前体）→ALA 被一系列的卟啉酶转化为原卟啉 IX → 铁螯合酶将Fe3+嵌入原卟啉 IX 中形成血红素 →Ho1催化血红素形成 BV IXα → BV IXα 由藻蓝素铁氧还蛋白氧化还原酶（PcyA）催化形成藻蓝胆素。
第一，生产水平低。研究人员筛选底盘菌株和酶源，优化拷贝数，为藻蓝胆素合成创造最佳条件，使初始菌株合成藻蓝胆素的滴度达到 9.1 mg/L 。
▲图丨大肠杆菌中藻蓝胆素的工程化代谢途径。过表达的基因以红色突出显示；异源表达的基因以蓝色突出显示；敲除的基因用红十字突出显示（来源：Synthetic and Systems Biotechnology）
第二，前体缺乏。血红素的合成由七个基因编码：hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH。血红素是合成藻蓝胆素的一个重要前体，然而，它在野生型大肠杆菌中仅产生痕量滴度的血红素。因此，它的内源性合成有限是藻蓝胆素生物合成的限速步骤。
研究人员通过关键基因的整合表达，从内源性来源增加了其合成所需的前体供应，使滴度达到 21.4 mg/L。
第三，催化效率。在增加血红素的供应后，还要将血红素高效转化为藻蓝胆素，即需要进一步提高合成藻蓝胆素的关键酶 Ho1 和 PcyA的催化效率。为此，研究人员利用短肽标签 RIAD-RIDD将Ho1和 PcyA 组装成一个多酶复合物，使得从血红素到藻蓝胆素的催化速率增强，滴度达到 23.5 mg/L。
▲图丨RIDD-RIAD和 Ho1-PcyA 之间不同联系的影响。A : 不同连接位置的人工自组装复合物的结构；B：图A对应的藻蓝胆素滴度（来源：Synthetic and Systems Biotechnology）
短肽标签 RIAD-RIDD 有以下几个优点：1. 多肽标签较短，降低对酶本身活性的影响；2. 亲和力高，能够确保酶复合物的完整性；3. 能够以 2:1 的比例进行酶组装；4. 可以将不同表达强度的酶在不改变酶结构的前提下，进行空间组装；5. 特异高效结合，且生理状态下稳定。
此外，为确定藻蓝胆素发酵的基本条件，研究人员对几种发酵培养基、诱导温度进行比较，并选择了 25℃ 的发酵温度和 GMD-Gly 培养基（主要碳源是甘油）。
最后，在一个 250 mL 摇瓶中确定了最佳的发酵介质；在一个 5 L 生物反应器中，藻蓝胆素最终滴度达到 147.0 mg/L。这是迄今为止报道的最高藻蓝胆素滴度。
研究人员表示，该研究为藻蓝胆素及其衍生物的工业化生产奠定了基础。
仍存在未解决的问题
在讨论中，作者指出了以下关键点。
第一，在生物合成过程中，前体供应是提高后续目标产物效价的关键因素。“以往的研究已经在大肠杆菌中实现了血红素的高效合成，但大量质粒的使用不仅对菌株造成较大负担，而且消耗了大量可用质粒。因此，使用替代方法来增强前体血红素的合成至关重要。”
将异源 DNA 整合到基因组中可以实现稳定表达并解决质粒的负担，研究人员通过多次评估列出了几个稳定表达的整合位点。
第二，高底物浓度对酶的催化效率有重大影响。原核生物中没有细胞器，导致底物分散在细胞质中。因此，许多研究人员试图通过提高酶附近的底物浓度来促进目标反应的转化率。
在多酶反应中，前一个酶合成的产物是后一个酶的底物。通过使两种酶彼此靠近，前一种酶释放的产物可以直接被后一种酶捕获。如果两种酶通过接头连接，则可以有效合成目标产物。
然而，作者也指出研究中仍然存在一些未解决的问题。
1、研究人员还整合了 C5 途径的基因hemAL，但意想不到的是，竟然没有检测到 PCB。“我们推测，使用 T7 启动子给底盘菌株带来了很大的负担，导致生长抑制影响了后续的合成，这一点还在探索之中。”
2、我们还没有完全优化 Ho1 和 PcyA 这两种 PCB 合成的关键酶。“我们计划利用酶工程对这些酶进行系统合理的修饰，进一步提高 PCB 的合成。”
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