华中农业大学考研，华中农业大学考研难度
SARS-CoV-2已对全球性经济和公共卫生造成巨大威胁。现已发现，nsp1、nsp3、nsp5、nsp6、nsp12、nsp13、nsp14和nsp16等非结构蛋白均能在不同节点抑制IFN-β产生。nsp5编码的 3C 样蛋白酶是主要的冠状病毒蛋白酶，通过切割病毒多蛋白和宿主免疫相关分子在病毒复制和免疫逃避中发挥重要作用。然而，nsp5作为3C样蛋白酶是否能像α-和 delta 冠状病毒nsp5切割NEMO，尚不清楚。
近日，华中农业大学肖少波教授团队阐述了SARS-CoV-2 nsp5作为3C样蛋白酶切割NEMO抑制IFN-β表达的机制，相关研究成果以题为“SARS-CoV-2 nsp5 Exhibits Stronger Catalytic Activity andInterferon Antagonism than Its SARS-CoV Ortholog”在线发表于国际高水平杂志《Journal of Virology》。
前期研究发现，Alpha冠状病毒PEDV nsp5和Delta冠状病毒属PDCoV nsp5都可以切割NEMO以拮抗I型IFN。而Beta冠状病毒属SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5是否也靶向NEMO进行切割尚不清楚。在本研究中，实验人员首先过表达两种冠状病毒nsp5蛋白，发现也能够切割NEMO蛋白，并且能够出现三条切割条带，这表明SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5可以在至少三个位点切割NEMO。
随后，研究人员通过构建多个NEMO蛋白突变体并与NSP5蛋白共转染，发现了NEMO蛋白的Q231，Q205,和E152处的氨基酸残基是SARS-CoV-2 nsp5介导的切割位点。为了进一步验证这三个切割位点，研究人员构建了这三个位点NEMO突变体，与nsp5共转染，结果发现NEMO没有出现切割条带。用SARS-CoV nsp5进行相同实验验证，结果与SARS-CoV-2 nsp5一致。这表明SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5均在E152、Q205和Q231三个位点切割NEMO蛋白。
为了阐明SARS-CoV-2 nsp5比SARS-CoV nsp5的具有更强的切割能力，研究人员通过比对这两种冠状病毒Nsp5的序列发现二者之间存在12个不同的氨基酸。对二者的三级结构分析发现SARS-CoV nsp5中氨基酸44至50的这个结构域形成了α-螺旋结构，而SARS-CoV-2 nsp5中的相应区域为环状结构。这两种nsp5结构差异，可能是造成酶活性不同的原因。在氨基酸44至50之间，S46存在于SARS-CoV-2 nsp5中，而A46存在于SARS-CoV-nsp5中。因此，推测第46位的残基可能是SARS-CoV nsp5和SARS-CoV-2 nsp5不同催化活性的潜在原因。通过构建nsp5蛋白S46A突变体，与NEMO共转染，结果发现SARS-CoV-2 nsp5蛋白S46A切割NEMO能力比未突变效率更差，而SARS-CoV nsp5的A46S突变体比未突变体切割能力更强。说明nsp5蛋白S46位点是其发挥切割NEMO的关键位点。
为了进一步研究46位S/A是否影响SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5在体外的催化活性，研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了四种重组蛋白，WTSARS-CoV-2 nsp5，WTSARS-CoV nsp5、SARS-CoV-2 nsp5(S46A)和SARS-CoV nsp5(A46S)。使用荧光共振能量转移分析方法（fluorescence resonance energy transfer assay ，FRET）评估纯化对TSAVLQSGFRKM切割活性。结果发现与SARS-CoV nsp5相比，SARS-CoV-2 nsp5在FRET测定中表现出更高切割活性，与细胞系统中发现的结果相似，SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5(A46S)显示出相似的催化活性，高于SARS-CoV nsp5和SARS-CoV-2 nsp5(S46A)。因此，认为第46位氨基酸是SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5催化活性的主要强/弱切割开关。
由于NEMO是RLRs介导的I型干扰素产生的关键激酶，同样也发现由病毒3CLpro切割NEMO抑制I型干扰素产生，研究人员依据NEMO切割位点设计了六个切割产物，验证是否对IFN-β产生有作用，结果发现所有的切割产物均不能诱导IFN-β的产生，表明SARS-CoV-2或SARS-CoV nsp5介导的NEMO切割破坏了IFN-β的产生。由于SARS-CoV-2和SARS-CoV两种冠状病毒nsp5切割NEMO能力不同，是否诱导IFN-β的产生有所差异。通过对IFN-β检测发现，SARS-CoV-2 nsp5抑制IFN-β能力强于SARS-CoV nsp5。由于VSV能够诱导IFN-β的高水平表达，研究人员使用VSV-GFP和流式细胞术分析GFP阳性细胞用于评估了SARS-CoV-2和SARS-CoV nsp5对内源性IFN表达水平的影响。结果发现，转染SARS-CoV-2 nsp5细胞中GFP阳性细胞的百分比高于转染SARS-CoV nsp5的细胞，表明SARS-CoV-2 nsp5表现出更强的抑制能力内源性干扰素的产生比SARS-CoV nsp5。通过SeV感染，验证不同病毒nsp5对VSV-GFP复制影响，结果发现SARS-CoV-2 nsp5诱导的VSV-GFP复制能力强于SARS-CoV nsp5。以上结果表明了，SARS-CoV-2 nsp5对SEV诱导的IFN产生的抑制作用更强
为了进一步研究SARS-CoV-2或SARS-CoV nsp5的第46位氨基酸是否抑制IFN-β产生的主要原因，通过对SARS-CoV-2突变nsp5（S46A）或SARS-CoV（A46S）进行双荧光素酶报告基因实验，结果发现SARS-CoV-2未突变nsp5具有能强抑制IFN-β表达的能力，而SARS-CoV（A46S）突变体具有更强抑制IFN-β表达的能力。同样，也使用VSV-GFP流式细胞术和SeV感染实验，发现与 SARS-CoV-2 nsp5 (S46A) 相比，SARS-CoV-2 nsp5对SEV诱导的IFN-β产生的抑制作用更强，而在 SARS-CoV nsp5 中引入A46S替代可增强抑制SEV诱导的 IFN-β产生，表明了SARS-CoV和SARS-CoV-2 nsp5第46位氨基酸是其发挥作用的重要位点。
综上所述，本研究发现发现SARS-CoV-2 nsp5和SARS-CoV nsp5在多个位点（E152、Q205和Q231）切割NEMO，不同于α和delta冠状病毒的切割。与SARS-CoV nsp5相比，SARS-CoV-2 nsp5在46位编码S而不是A具有更强的催化活性、增强的NEMO裂解以及增强SARS-CoV-2 nsp5的干扰素拮抗作用。
本研究获得了国家重点研究开发项目2021YFD18011、国家自然科学基金31730095、湖北省科技厅COVID-19应急项目2020FCA003的资助。
文章链接：https://journals.asm.org/doi/epub/10.1128/jvi.00037-22
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本期编辑：小黄
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